重组蛋白纯化技术梳理

蛋白纯化的挑战是不言而喻的，鉴于表达宿主中存在复杂的生物大分子混合物，通常需要进行重组蛋白的提取。随着新一代色谱介质和自动化系统的出现，过去研究人员需要花费几个月时间来建立一个蛋白纯化操作流程的日子已经一去不复返了。然而，并不是所有的问题都可以用复杂的色谱柱填料和实验室设备来解决。在寻找样本预处理的最佳条件，选择合适的缓冲条件，或处理蛋白质的不溶性时仍存在困难。

在开始纯化蛋白质之前，我们应首先了解所纯化蛋白质的用途、纯度、所需的浓度以及储存条件。在设计和确定一个经济、省时且能进行大量目的蛋白纯化的方案时，所有因素都是至关重要的。

图1 纯化过程初始设计时重要的理化参数

蛋白质的原料

虽然从蛋白质的天然来源中进行蛋白纯化是相对常见的，但随着近年来基因操作和重组表达领域的不断发展，可实现对目的蛋白进行过表达，现有的过表达系统包括大肠、酵母、昆虫及哺乳细胞。每种宿主表达系统都有各自的优势和不足。例如，E. coli系统具有最高的表达量，一般的平均产量有2.5 g/L，但是它缺乏任何的翻译后修饰。另外，如果蛋白需要糖基化，那么相较于昆虫和哺乳细胞，酵母系统可以提供大量的糖基化修饰。表达系统的选择依赖于蛋白自身的特性以及它的下游应用。

提取方法

大多数情况下，提取过程取决于蛋白质的来源，它可能是细菌、酵母或哺乳动物细胞，也可能是胞内/胞外。从细胞内提取蛋白往往面临着回收率和纯度低的问题。提取的主要目标应该是获得不降解或不变性的的所需蛋白质，且污染物极少甚至没有。

通常对提取培养基、时间、温度、裂解设备及能量输入（搅拌速度、压力等）等参数进行策略性改变来优化提取方案。需要注意的是，方法的选择应该是尽可能温和的，因为过于剧烈或苛刻的条件可能会使所需要的蛋白质变性或释放内蛋白水解酶，并引起普遍的酸化。提取过程中无法回避的主要问题之一是蛋白水解或核酸污染。然而，通过在提取培养基中加入核酸酶或蛋白抑制剂，且在低温环境下操作可在某些程度上避免蛋白水解和核酸污染。因此，对于优化设计来说，为了使蛋白质的含量和活性最大化，在小范围内标准化初步实验是非常必要的，之后可以有效放大。

提取试剂的组成应该能使蛋白保持稳定，并以最大的回收率和纯度使蛋白从细胞中有效释放出来。当在制备提取试剂或裂解缓冲液时应考虑下述因素：缓冲液盐浓度、pH、还原剂、变性剂、去污剂、金属离子、蛋白酶抑制剂和DNA酶。

溶解度和纯化策略设计

蛋白的溶解度

在任何蛋白的纯化中，蛋白溶解度都是一个关键参数。不同蛋白间的溶解度明显不同，其高度依赖于蛋白的物理化学特性及其所处的溶剂。很大程度影响蛋白溶解度的参数包括溶剂的pH、离子强度、温度，以及蛋白表面暴露的氨基酸侧链类型。在溶剂中带有电荷较少的蛋白和含有疏水氨基酸的蛋白通常是难溶的。由于很难准确预测蛋白的溶解特性，我们应该通过改变不同的条件，并结合表明不同条件下蛋白溶解度的SDS-PAGE实验结果，仔细设计蛋白的初步研究。

盐析

盐析，通常被称为盐诱导的沉淀或盐分馏法，其主要基于蛋白与盐的相互作用。盐倾向于在水溶液（溶剂）中解离分解，这是盐析过程发生的基础。当盐浓度升高，盐离子逐渐与水分子结合，同时导致与蛋白带电部分结合的水分子数量减少。最终，由于蛋白间的相互作用强于蛋白与溶剂的相互作用，所以蛋白质分子间趋向于相互作用，从而导致蛋白质聚集和随后的沉淀。这个过程称为盐析（图2）。重要的是，不同蛋白通过盐析进行蛋白沉淀时所需的盐浓度是不一样的。硫酸铵是进行蛋白沉淀最常用的盐之一。

图2 蛋白质溶解度与盐浓度的关系。蛋白质随盐浓度变化的二维溶解度曲线示意图。溶解曲线将平面划分为两个区域—盐溶（绿色）和盐析（粉色）。

盐溶

蛋白溶解度受溶液中离子强度的影响。如果把蛋白质放在像水一样的水溶液中，那么溶液中唯一的离子成分就是蛋白质分子。虽然水是极性的，但它只会轻微电离，因此蛋白质由于蛋白分子间的离子相互作用而趋向聚集。相比于蛋白质-水间的相互作用，蛋白-蛋白间的相互作用更易导致不可逆的聚集。NaCl等盐离子浓度较低时，其他离子的出现可以与离子的蛋白间相互作用产生竞争。溶液中的这些离子往往保护蛋白分子不受其他蛋白分子的电荷影响。蛋白分子间静电作用的减弱，最终增加了蛋白的溶解度，被称之为“盐溶”。然而，当离子强度开始变得过高时，它会对蛋白的溶解度产生负面影响，导致“盐析”。

蛋白的盐溶通常发生在其等电点（pI）附近。除了静电效应外，蛋白表面有限的电荷也会影响与蛋白相关的水分子。总而言之，盐离子与蛋白分子的电荷基团结合增加了蛋白的溶解度，从而导致蛋白的“盐溶”。

包涵体蛋白的处理

在E.coli中进行重组蛋白的大量表达时往往会形成不可溶的和聚集的蛋白，这些蛋白被称为“包涵体”。除了不可溶之外，包涵体也没有蛋白的天然构象，因此，这就要求对包涵体进行溶解处理和重折叠，以使目的蛋白具有天然构象。这通常需要大量的优化，而且非常耗时。此外，在蛋白重折叠过程中，蛋白量可能会出现明显的损失。通过改变蛋白表达中的几个条件来避免E.coli中包涵体的形成。在多数情况下，往往通过低温（如18℃）和低于0.5 mM IPTG（异丙基硫半乳糖苷）诱导表达来处理包涵体形成的问题。

对于包涵体的分离，收集表达目的蛋白的细胞，机械裂解，然后在4℃条件下高速（20000 g）离心15 min。离心获得的沉淀即为包涵体。然后用去污剂对沉淀进行洗涤，如1% Triton-X，随后用8 M尿素或6 M盐酸胍等化学变性剂对蛋白进行变性处理。变性步骤可重复多次直至获得最大回收率。包涵体经过这些步骤处理后往往有大于90%的纯度。若目的蛋白中含有杂质，可以进行亲和层析纯化或盐析沉淀以增加它的纯度。通过稀释或透析的方式逐渐移除变性剂，使变性后的蛋白进行重折叠。

变性蛋白在重折叠过程中的一些关键参数包括温度、pH、还原剂（如DTT、TCEP）和添加剂（往往结合使用）。然而，对于成功的重折叠来说，更重要的是要进行多次条件摸索和后续的条件优化。蛋白重折叠的成功率往往是不尽如人意的。因此，需要测试大量的重折叠条件，以便获得大量高纯度且具有生物活性的蛋白质。除了稀释或透析方法外，未折叠蛋白溶液中的变性剂也可以用不同的层析技术去除。

层析法的概述

柱层析，通常使用液相色谱法（LC）进行重组蛋白的纯化。层析法中，固定相被填充在层析柱上，利用泵或重力流使得液体流动相通过层析柱。样品混合物在层析柱的一端引入，随着流动相在层析柱的另一端被洗脱下来。混合物中各组分的分离取决于分子在固定相和流动相之间的分配，而这主要是基于它们分子量的差异。为了目的蛋白获得令人满意的纯度和均一性，通常使用亲和层析、离子交换层析，以及体积排阻色谱等技术对重组蛋白进行纯化。

亲和层析

有基于亲和的多种方法被用于纯化重组蛋白。基于亲和纯化的常用策略是融合标签（例如，添加在重组蛋白上的氨基酸序列）的使用，标签对固定在层析柱上的配体有亲和性。表1列举了一些常用的标签。

表1 用于重组蛋白纯化的常用融合标签

注：AC：亲和层析，IEX：离子交换层析，a.a.：氨基酸，kDa：千道尔顿

特别是，组氨酸（His）标签（由6个或更多组氨酸残基构成的多肽序列）可以添加在重组蛋白的N端或C端，其通常用于从细胞裂解获得的蛋白混合物中纯化目的蛋白。His标签标记的蛋白对二价金属离子（如Ni⁺²或Zn⁺²）具有亲和性，因此，这种层析技术又称为固定化金属亲和层析（IMAC）。IMAC系统的主要优势是它能接受宽泛的缓冲条件，包括去污剂和化学变性剂等添加剂的存在。此外，树脂可以再生，并且可以重复使用几次，因此，能够使学术界和工业界发展经济的纯化策略。图3提供了Ni-NTA亲和层析的示意图。

图3 使用Ni-NTA亲和层析纯化多His标记蛋白的示意图

多聚组氨酸标签最主要的缺点之一是蛋白和IMAC柱的非特异性结合。然而，由于分子量很小，所以His标签也有一些优势，比如它几乎不会影响蛋白功能。大多数情况下，仅一步纯化即可将蛋白纯度提升至90-95%。IMAC树脂不受细胞裂解产物中蛋白酶和核酸酶的影响，这使得它适用于粗提取物的纯化。His标签的优势之一是它可与其他亲和标签（见表1）联合使用，实现对同一蛋白的标记，为纯化过程提供了很灵活的选择空间。总之，相较于基于亲和的其他纯化方法，IMAC是一种快速且便宜的纯化方法。

与多聚组氨酸标签类似，其他可选择的亲和标签，如MBP或GST也被频繁使用；然而，由于这些标签的分子量较大，可通过在标签和目的蛋白间引入特定的酶切位点，以便在后续的处理中将标签去除。由于大标签涉及额外的处理步骤，因此这些大标签的使用增加了纯化重组蛋白的后续处理成本。

离子交换层析（IEX）

IEX是基于蛋白带电基团与柱基质间的静电相互作用。IEX中蛋白的分离取决于蛋白表面的电荷、流动相的pH和盐浓度。IEX普遍应用于未带标签重组蛋白的纯化。蛋白质与层析柱的结合依赖于蛋白质表面电荷和柱基质所带电荷间的相互作用（图4a）。这种相互作用是可逆的，可以通过盐的线性梯度或改变pH来破坏这种作用，从而使层析柱上结合的蛋白被洗脱下来。

在温和的条件下，IEX为重组蛋白提供高的结合能力和分离分辨率。另外，由于IEX具有可放大（尤其是对重组蛋白），价格适中，广泛的适用性等优点，已使IEX成为应用最广泛、用途最广泛的液相色谱技术之一。

图4 离子交换层析的示意图 (a)阴离子和阳离子交换剂分别与带负电荷和正电荷的分子结合。(b)阴离子交换层析流程图。

体积排阻色谱

体积排阻色谱（SEC），也被称为凝胶过滤层析，根据其流体动力学体积和分子量的差异分离大分子。固定相由惰性球状珠或具有特定孔径的凝胶组成。比凝胶孔径大的蛋白不能渗入到凝胶颗粒中，通过珠子间的空隙首先被洗脱下来。另一方面，比凝胶孔径小的蛋白扩散到孔隙中，洗脱时间按比例延长（即从蛋白进入到孔隙至蛋白检出所花费的时间。因此，SEC也被普遍称为凝胶过滤层析。SEC中，蛋白分子不直接与流动相发生作用，因此，缓冲液的成分不影响色谱柱的分辨率（即峰的分离程度）。相比小蛋白，大蛋白的保留时间要短，这得以实现蛋白分离。除了凝胶孔径大小外，层析柱的分辨率也受柱床高度、流速、样本体积及蛋白分子量的影响。通常来说，当流速控制在慢速至中速，层析柱长且窄，凝胶孔径小及样本体积小（占层析柱总体积的1-5%）时有可能获得最高的分辨率。体积排阻色谱的总设计如图5所示。由于SEC具有良好的脱盐性能，因此它被广泛应用于重组蛋白纯化中最后的精制步骤。

图5 体积排阻色谱（SEC）的示意图

结论

重组蛋白生产的瓶颈是蛋白纯化的成本。因此，在过去的几十年里，研究者们为改进现有策略和发展新的纯化方法做出了极大努力。这里，我们介绍了细菌系统表达的重组蛋白的一般纯化步骤，如E.coli，它是蛋白表达最首选的微生物细胞工厂之一。但E.coli系统适合稳定表达折叠的球状蛋白，对膜蛋白或膜相关蛋白的表达和纯化来说往往是困难的。我们介绍了E.coli中表达和纯化重组蛋白时遇见挑战的可能途径。虽然这些概述的方法中的很多种可能会在不同阶段中失败，但由于重组蛋白的表达和纯化往往是蛋白特异性的，因此必须找到方法来标准化操作，且进行广泛的故障排除来克服这些困难。

原文来源：摘译自Textbook on Cloning, Expression and Purification of Recombinant，Chapter 5

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