蛋白纯化技术简介

新手总是查不到详细一点的蛋白纯化资料，苦不堪言。课本上内容一带而过，文献里一笔了事，一遇到蛋白纯化总是混乱不堪。这节介绍一下4大常用蛋白纯化技术的原理、实操步骤以及注意要点，来吧，一起学习学习。

一、盐析法-硫酸铵沉淀

1.原理

利用不同蛋白质在不同浓度中性盐溶液中的溶解度差异进行分离。向蛋白质溶液中加入中性盐(如硫酸铵)，盐离子与水分子结合，破坏蛋白质的水化膜，同时抑制蛋白质弱电解质的解离，使蛋白质带电荷减少，更容易聚集析出，从而实现蛋白质的沉淀和分离。

不同蛋白沉淀盐浓度不同，可实现分级分离、初步除杂。

2.试剂

主要计算硫酸铵的用量。

硫酸铵饱和度：在某温度下，溶液中硫酸铵的溶解量占该温度下最大可溶解量的百分比。

比如，温度25°C，目标饱和度为50%，100m蛋白溶液，查表可得25°C下50%=313g/L，100mL溶液需要加：313g/LX0.1L=31.3g。

3.操作步骤

（1）准备样品：低温破碎裂解细胞后，离心取上清；

（2）准备硫酸铵：准备硫酸铵粉末，初步计算硫酸铵用量；

（3）添加硫酸铵：磁力搅拌条件下，缓慢加入硫酸铵；

（4）沉淀蛋白：连续搅拌30min，溶液中会出现浑浊，沉淀蛋白；

（5）收集蛋白：4℃，13000rpm离心，去上清，收集沉淀，沉淀即为蛋白；

（6）洗涤沉淀：用缓冲液或去离子水洗涤沉淀，离心后去上清，收集沉淀；

（7）溶解沉淀：用适合的缓冲液溶解蛋白沉淀，使蛋白完全溶解；

（8）透析脱盐：利用透析袋去除残留硫酸铵。

（9）检测：利用SDS-PAGE蛋白电泳检测纯化蛋白。

4.注意事项⚠️ 

（1）蛋白质易变性，操作过程既要注意温度，也要注意硫酸铵在不同温度时的溶解度。

（2）硫酸铵必须少量多次添加，边搅边加，添加太快会导致局部硫酸铵浓度过大，析出不同的蛋白，无法分离蛋白。

（3）盐析后必须透析除盐，否则影响后续挂柱。

（4）该方法只是粗提，无法分离溶解度相近的蛋白。

（5）如果不清楚硫酸铵沉淀蛋白浓度，可以向上清中继续加入硫酸铵粉末，继续沉淀蛋白，连续沉淀几个梯度，利用SDS-PAGE蛋白电泳检测，选择合适的浓度沉淀相应蛋白。

二、亲和层析-镍柱亲和层析

1.原理

利用化学结合的特异性，将目标分子（如His-tag)与固定在层析介质上的镍离子(Ni2+)之间的特异性结合，通过亲和层析轻松地从细胞裂解液中分离出目标蛋白。

 因His标签蛋白中的组氨酸残基侧链含有咪唑基团，可与Ni2+形成配位键，实现特异性吸附。通过调节缓冲液中咪唑浓度竞争性洗脱目标蛋白，低浓度咪唑洗去杂蛋白，高浓度咪唑破坏His-tag与Ni2+的结合，释放目标蛋白。

因此，该方法可实现目标分子的分离纯化，特异性强、纯化倍数高。

2.试剂

（1）裂解缓冲液：20mM Tris-HCI (pH8.0)，500mM NaCI，5mM咪唑,1mMPMSF(蛋白酶抑制剂)，1mg/mL溶菌酶(可选)；

（2）平衡缓冲液：20mM Tris-HCI (pH8.0)，500mM NaCI，5mM咪唑。

（3）洗杂缓冲液：20mM Tris-HCI (pH8.0)，500mM NaCI，20-50 mM咪唑(梯度优化)。

（4）洗脱缓冲液：20mM Tris-HCI (pH 8.0)，500mM NaCI，250-500mM 咪唑。

（5）Ni-NTA亲和层析柱

3.操作步骤

（1）准备样品：低温破碎裂解细胞后，离心取上清；注：跟上面不同的是，这里的蛋白必须有His标签。

（2）镍柱预处理：将Ni-NTA填料装柱(或使用预装柱)，用5倍柱体积(CV)去离子水冲洗。用5CV平衡缓冲液平衡柱子至基线稳定(pH和电导率与样品一致)；

（3）上样与结合：将样品以0.5-1mL/min流速缓慢上样至柱，确保His标签蛋白充分结合，收集流穿液(用于后续分析是否结合完全)；

（4）洗杂蛋白：用5-10CV平衡缓冲液冲洗未结合的杂蛋白。逐步增加咪唑浓度(如20mM一50mM)洗去弱结合杂蛋白，监测A280至基线平稳；

（5）洗脱目标蛋白：使用含250-500mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱目标蛋白，收集洗脱峰(A280显著升高时)，分多管收集，标记为Elution1、Elution2等；

（6）柱再生与保存：用5V含500mM咪唑的缓冲液清洗柱子，去除残留蛋白。用5V去离子水冲洗后，以20%乙醇保存镍柱(4°C)；

（7）检测：利用SDS-PAGE蛋白电泳检测纯化效果。

4.注意事项⚠️ 

（1）蛋白样品必须澄清，严禁浑浊上样，容易堵柱。

（2）体系避免高浓度EDTA、强还原剂，会脱镍、挂柱失败。

（3）上样流速不能过快，否则挂柱不完全。

（4）梯度洗杂+高浓度洗脱，不要一步高浓度洗脱。

三、离子交换层析

1.原理

根据蛋白分子的表面电荷特性分离和纯化目标蛋白的方法，通过蛋白与带相反电荷的固定相(离子交换介质)之间的静电相互作用实现分离。

蛋白在不同pH条件下的表面电荷由其等电点(pI)决定：pH<pl，蛋白带正电；pH>pl，蛋白带负电。

阳离子交换层析：介质带负电，吸附正电荷蛋白。

阴离子交换层析：介质带正电，吸附负电荷蛋白。

通过连续改变洗脱环境的pH或盐浓度，创造竞争条件，使结合力不同的蛋白质依次被替换下来，达到分离目的。

2.试剂

（1）平衡液A：低盐结合缓冲液（20~50 mM Tris/PB）

（2）洗脱液B：同pH，加高盐（0.5~1M NaCl）

（3）清洗液：0.5M NaOH、20%乙醇

3.操作步骤

（1）准备样品：低温破碎裂解细胞后，离心取上清；

（2）选择层析柱：根据蛋白等电点选择对应离子柱；

（3）装柱：干粉树脂预处理，装入层析柱，自然沉降，柱床平整；

（4）柱平衡：先走纯水3-5 倍柱体积，再用平衡液 A冲洗5-10倍柱体积，流出液 pH、电导与平衡液一致即平衡完成；

（5）上样：以流速1-2mL/min，将蛋白样品上样到离子交换柱上，

收集穿透液，检测是否流穿（没结合住）；

（6）洗杂蛋白：继续用平衡液 A 冲洗3-5 倍柱体积，把未结合、弱结合杂蛋白全部冲出去，至 A280 归零；

（7）梯度洗脱：用不同pH值或离子强度的缓冲液进行梯度洗脱，收集洗脱液，检测其中的蛋白质；

（8）柱再生与保存：用0.5M NaOH 浸泡或冲洗 3-5 倍柱体积，用纯水冲至中性，20% 乙醇封存，4℃保存。

4.注意事项⚠️ 

（1）上样样品必须低盐，高盐直接无法挂柱。

（2）缓冲液pH必须稳定，波动会导致吸附异常。

（3）禁止在pI附近操作，蛋白极易沉淀聚集。

（4）优先线性梯度洗脱，分离效果远优于一步洗脱。

（5）若目标蛋白直接流穿，说明pH选错 ，重新配制。

（6）该方法分辨率较高，可通过调整缓冲液的pH值和离子强度来优化分离效果，适用于各种带电蛋白质的分离，且可处理较大体积的样品。

四、凝胶过滤层析-分子筛

1.原理

利用具有分子筛性质的凝胶颗粒，根据蛋白质分子大小进行分离，在流经装填有凝胶颗粒的层析柱时，分子量较小的蛋白质可扩散进入凝胶内部孔道，迁移路径长、流出慢；而分子量大的蛋白质因被排阻在凝胶颗粒之外，直接随流动相快速洗脱，从而实现按分子尺寸大小的分离。（分子量大的先洗脱，分子量小的后洗脱）

2.试剂

（1）缓冲液：PBS、Tris-HC:

（2）选凝胶型号：

Sephadex G-75：分离3k-70k Da蛋白

Sephadex G-100：10k-100k Da

Sephacryl S-100HR：高速分离蛋白

3.操作步骤

（1）准备样品：低温破碎裂解细胞后，离心取上清；

（2）选择凝胶型号：根据蛋白大小选择；

（3）装柱：干粉树脂预处理，装入层析柱，自然沉降，柱床平整；

（4）柱平衡：洗脱缓冲液匀速冲洗3~5 倍柱体积，流出液 pH、电导与平衡液一致即平衡完成；

（5）上样：缓慢将蛋白样品上样到凝胶柱，待样品全部渗入胶床后，立刻加少量缓冲液封住液面；

（6）洗杂蛋白：连通洗脱缓冲液，匀速恒流洗脱，流速宜慢，连续收集；

（7）检测判定出峰顺序：最先出来是大分子蛋白，中间出来是中等分子量，最后出来的是小分子蛋白、盐离子、色素等；

（8）柱再生与保存：洗完直接用 3~5 倍柱体积缓冲液冲净即可。

4.注意事项⚠️

（1）上样体积不能过大，否则分辨率暴跌。

（2）流速必须缓慢平稳，速过快分子来不及筛分，分离不纯。

（3）有聚集体一定要提前去除，聚合体最先出峰。

（4）不适合分离分子量接近的蛋白。

（5）该方法只按分子量大小分离，与蛋白电荷、极性无关。

（6）柱子必须垂直放置，柱床压实均匀，不能出现气泡、断层、裂纹。

五、总结

1.盐析法粗提。

2.亲和层析或离子交换层析去除大部分杂蛋白。

3.凝胶过滤层析进行精细纯化。