重组蛋白常用标签系列(二)：Fc融合蛋白标签

今天给大家介绍一下Fc标签。IgG抗体的恒定片段（Fc结构域）是一种新型方便的亲和标签，可以促进蛋白质的检测、纯化和定位，并对蛋白质的产量、溶解度、稳定性、折叠甚至活性产生积极影响。此外，Fc融合蛋白广泛用于药物发现、药物递送、疫苗设计和受体-配体相互作用的实验研究。FDA 批准的治疗性 Fc 融合蛋白如下表所示。

Fc 标签通常具有两个重链恒定区结构域（CH2 和 CH3）和一个铰链区域。其通常在表达为抗体样分子后使重组蛋白二聚化，并在融合蛋白与其受体之间提供高亲和力相互作用。与抗体分子类似，Fc标记的单体通过二硫键进行连接。柔性的铰链区域有助于 Fc 融合蛋白的正确折叠，并使Fc和靶蛋白能够独立发挥作用。

图1 Fc标签结构域

总的来说，Fc-tag对于融合蛋白有以下优点：

1. 二聚化和多聚化；

2. 提高灵活性；

3. 增加血清半衰期；

4. 提高重组蛋白稳定性和溶解度；

5. 增加重组蛋白的表达或分泌；

6. 易于检测Fc标签的重组蛋白；

7：特异性强，通过proteinA/G亲和层析易于纯化重组蛋白；

8. 激活和抑制信号的传递；

9. 激活或抑制细胞因子分泌等

接下来详细讲解该如何进行Fc融合蛋白的重组表达！

载体构建及密码子优化

分子构建在DNA水平上进行，靶蛋白的C末端通常直接或与接头融合到Fc片段的N末端。如有必要，将linker作为合适的切割位点，可以从目标蛋白中去除Fc标签。在两个蛋白之间放置切割位点以在纯化后切割标签蛋白。常用的linker包括丝氨酸蛋白酶、凝血酶和丝氨酸内肽酶Xa因子等。凝血酶是一种以蛋白酶形式存在的linker，它识别序列leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(凝血酶裂解位点)，并切断Arg和Gly之间的肽键。Xa因子也通常用于从表达蛋白中去除组氨酸或Fc标签，其在Ile-Glu-Gly-Arg序列的最后一个氨基酸之后切割。这些linker的目的是在Fc标签且仅用于蛋白质纯化的应用中选择性地切割融合蛋白。此外，根据具体的实验需求，靶蛋白可以位于融合蛋白的C末端，取决于不影响蛋白质的正确折叠和活性。Fc融合蛋白的铰链区域提供了构象灵活性，使Fc和靶蛋白能够独立发挥作用。

设计Fc融合蛋白的要点是确保核苷酸序列位于翻译过程的框架中。根据重组蛋白表达系统如细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等的不同，应对融合蛋白的DNA序列进行密码子优化。密码子优化涉及与蛋白质表达不同阶段各种关键因素，如密码子适应性、mRNA二级结构以及转录和翻译过程中的各种负、顺式作用元件，所以优化DNA序列是必要的。对于高度重复序列、长序列、低GC含量等序列应使用适当的生物信息学软件评估。

Fc融合蛋白的表达鉴定

对于没有可用于新的重组蛋白的抗体来确定蛋白质表达的，抗 IgG的抗体可以作为检测重组 Fc融合蛋白表达的标签抗体。如在人或小鼠Fc标签的情况下，Fc融合蛋白可以通过ELISA或Western Blot的抗人IgG1-HRP或抗小鼠IgG2a-HRP或免疫荧光测定中的抗人IgG1-FITC或抗小鼠IgG2a-FITC来检测。

Fc融合蛋白的纯化

proteinA/G与免疫球蛋白Fc之间的强选择性相互作用使其成为纯化和检测免疫球蛋白的有用工具。Fc-tag是一种用于Fc融合蛋白纯化的工具。在该方法中，靶蛋白不直接与色谱基质相互作用，可以避免由于蛋白质直接相互作用（例如离子交换）导致的变性，使得任何蛋白质都可以以其天然构象进行纯化。

溶液配制

所用缓冲液使用前建议用 0.45 μm 滤膜过滤

平衡缓冲液: 20-50 mM Na2HPO4, 150 mmol/L NaCL, pH 7.0-8.0洗脱缓冲液: 0.1 M glycine, pH 2.5-3

中和缓冲液: 1 M Tris, pH 8.5

为有效结合融合蛋白，上样的样品需要确保一定的离子强度和 pH 值，细胞培养液上清用平衡缓冲液至少进行 1:1 稀释，或者将样品用平衡缓冲液透析。

Fc重组融合蛋白的纯化

装柱：

(1) 将柱内及柱子底端用水润湿并保持一小段液位（液面略高于滤膜），务必使底端无气泡。

(2) 用玻璃棒引导proteinA/G填料沿着柱内壁一次性倒入柱内，注意勿使产生气泡。打开柱子出液口，使介质在柱内自由沉降，连结好柱子顶端柱头。

(3) 打开蠕动泵，让缓冲液用使用时流速的1-3倍的流速流过，使柱床稳定。

平衡：用5-10倍柱体积的平衡缓冲溶液平衡柱子。

上样：0.45μm过滤后的含有重组目的蛋白的上清液流过proteinA/G柱（流速1 mL/min），收集流穿液。

洗杂：用5-10倍柱体积的平衡缓冲溶液洗去层析柱中未结合杂蛋白。

洗脱：用洗脱缓冲液洗脱Fc融合蛋白，并立刻加入约 1/10 （具体比例需要摸索）洗脱液体积的中和缓冲液，调节 pH 至 7.4。

再生：填料先用 10 ml 洗脱缓冲液洗涤树脂，再用 5 ml 平衡缓冲液洗涤填料。

保存：填料置换到20%的乙醇溶液中4℃冰箱保存。

得到的蛋白洗脱液采用SDS-PAGE分析纯化情况。收集含有目的蛋白的洗脱液进行后续实验。

重组蛋白常用标签系列(二)：Fc融合蛋白标签

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